Vai trò của nhiệt độ và cơ chế điều nhiệt cột trong sắc ký lỏng
08/01/2024Giới thiệu
Việc sử dụng nhiệt độ cao trong HPLC có triển vọng tương tự như việc sử dụng các hạt nhỏ hơn trong UHPLC—hiệu suất tốt hơn và giảm thời gian phân tích. Nếu nhiệt độ cột tăng lên, quá trình tách sắc ký sẽ trở nên nhanh hơn và nói chung là hiệu quả hơn. Tuy nhiên, phần trăm giảm thời gian lưu thường không giống nhau đối với tất cả các hợp chất của hỗn hợp mẫu và khoảng cách giữa các peak thường bị thay đổi.
Tại sao Kiểm soát Nhiệt độ trong Sắc ký Lỏng lại quan trọng đến vậy?
Nếu nhiệt độ cột tăng lên thì quá trình tách sắc ký sẽ nhanh hơn. Dựa trên nguyên tắc chung cho sự phân tách đẳng dòng pha đảo, có thể dự đoán thời gian lưu sẽ giảm từ 1–2% cho mỗi lần tăng nhiệt độ cột 1°C. Trong trường hợp đó, hệ số dung lượng của các chất trong mẫu thay đổi, các chất có thể rửa giải đồng thời hoặc độ chọn lọc của chúng có thể bị đảo ngược do một biếng động nhỏ của nhiệt độ cột (xem Hình 1). Do đó, kiểm soát nhiệt độ cột thích hợp là yếu tố cần thiết trong các phân tách sắc ký lỏng mà cần chú trọng tới độ phân giải của cặp peak quan trọng hoặc nếu thời gian lưu được sử dụng để định tính từng chất trong mẫu.
Hình 1. Sắc ký đồ của cùng một mẫu ở các nhiệt độ khác nhau
Khi nào thì mức nhiệt độ cao hơn môi trường xung quanh được sử dụng trong sắc ký lỏng?
Rút ngắn thời gian chạy là mục tiêu chính khi tăng nhiệt độ tách. Với các chất trung tính, mục tiêu này đạt được mà không cần xử lý quá nhiều đối với phương pháp vì những thay đổi về độ chọn lọc không xảy ra thường xuyên (xem Hình 2). Với các hợp chất phân cực và đặc biệt là hợp chất ion, sự thay đổi độ chọn lọc xảy ra (xem Hình 1) dẫn đến cần thẩm định lại phương pháp trong nhiều trường hợp. Giảm áp suất ngược của hệ thống là một mục tiêu khác khi tăng nhiệt độ. Khi nhiệt độ cột tăng lên, độ nhớt của pha động giảm, do đó sự đối kháng dòng chảy trong cột cũng như áp suất ngược của hệ thống cũng giảm theo.
Hình 2. Thời gian phân tích ngắn hơn nhờ vào việc tăng nhiệt độ tách
Cả hai yếu tố: độ nhớt của pha động giảm và nhiệt độ tăng đều cải thiện sự khuếch tán trong quá trình sắc ký. Kết quả thường sẽ làm cho peak hẹp hơn, điều này cũng còn tùy thuộc vào tốc độ dòng của pha động (xem phương trình Van Deemter). Peak hẹp hơn cho thấy hiệu năng phân tách cao hơn. Các peak hẹp hơn thì cũng cao hơn so với peak tương đương ở nhiệt độ thấp hơn, dẫn đến giới hạn phát hiện thấp hơn. Thêm vào đó, nếu áp suất ngược ở nhiệt độ thấp đã ở mức vận hành tối ưu của hệ thống sắc ký lỏng (LC), thì thời gian chạy có thể được rút ngắn hơn nữa bằng cách tăng tốc độ dòng pha động cho đến khi đạt được áp suất ngược ban đầu và điều chỉnh gradient pha động đáp ứng với tốc độ dòng mới.
Tóm lại, việc tăng nhiệt độ phân tách được sử dụng để rút ngắn thời gian phân tích, nâng cao hiệu quả phân tách, đạt được áp suất ngược hệ thống thấp hơn hoặc, trong các trường hợp đặc biệt, để đạt được độ chọn lọc phù hợp với các hợp chất phân cực (Hình 1).
Trên thị trường có những loại buồng cột nào?
Các loại thiết kế và khái niệm điều nhiệt cột khác nhau đều có trên thị trường. Hầu hết các hệ thống LC đều có buồng cột chuyên dụng. Nhìn chung, kiểu điều nhiệt như vậy hoặc là dùng khối nóng hoặc là bể không khí. Với khối nóng, cột được điều nhiệt trực tiếp bằng nguồn nhiệt thông qua sự dẫn nhiệt hiệu quả của khối kim loại có rãnh hoặc băng gia nhiệt linh hoạt mà cột gắn vừa khít trong đó. Sự tiếp xúc trực tiếp giữa cột và nguồn nhiệt mang lại khả năng gia nhiệt thành cột theo thời gian thực hiệu quả.
Bể không khí kém hiệu quả hơn trong việc kiểm soát nhiệt độ cột theo thời gian thực. So với kim loại, không khí là chất dẫn nhiệt rất kém. Do đó, việc cân bằng nhiệt độ cột mất nhiều thời gian hơn với bộ điều nhiệt không khí tĩnh so với khối nóng. Bên cạnh đó, bộ điều nhiệt không khí tĩnh không thể phản ứng nhanh với sự thay đổi nhiệt độ đến từ lõi bên trong của cột. Hệ thống tuần hoàn không khí thực hiện việc truyền nhiệt từ nguồn sang thành cột bằng đối lưu cưỡng bức. Hiệu quả của việc gia nhiệt cột được kiểm soát bằng tốc độ quạt của bộ điều nhiệt không khí cưỡng bức.
Khái niệm ổn nhiệt cột hiện đại sử dụng phần tử Peltier làm nguồn nhiệt.
Buồng cột kiểu này cũng giúp làm mát cột nhanh chóng và hiệu quả như nguồn nhiệt. Các buồng cột này cho phép người dùng làm việc ở phạm vi nhiệt độ rộng hơn, bắt đầu từ 15—20°C dưới nhiệt độ không khí xung quanh cho đến các giá trị trong khoảng 70°C đến 130°C.
Nguyên tắc điều nhiệt của buồng cột có ý nghĩa gì?
Với bộ gia nhiệt khối nóng, thành cột được điều nhiệt theo thời gian thực và rất hiệu quả. Do đó, ít nhất thành cột được giữ không đổi ở nhiệt độ buồng cột đã đặt. Nếu pha động đi vào cột có nhiệt độ khác so với nhiệt độ buồng cột đã cài đặt thì khối nóng buộc thành cột không thay đổi nhiệt độ nhiều. Do đó, thành cột hoạt động như một bộ trao đổi nhiệt và làm dịu pha động trong vùng thành cột. Thành cột nằm trong khối nóng thể hiện trạng thái gần như đẳng nhiệt vì có sự thay đổi nhiệt độ tối thiểu. Do những hạn chế thực tế trong đời sống thực, một hệ thống không bao giờ có thể đẳng nhiệt hoặc đoạn nhiệt 100%, tuy nhiên để dễ đọc, chúng tôi sẽ bỏ qua giá trị gần đúng trong các tài liệu tham khảo sau này.
Với bộ điều nhiệt không khí tĩnh, thành cột được điều nhiệt gián tiếp và không hiệu quả. Cột từ từ đạt đến nhiệt độ đã cài đặt. Nếu pha động đi vào cột có nhiệt độ khác, bộ điều nhiệt không khí tĩnh không thể giữ thành cột ở nhiệt độ buồng cột đã cài đặt. Hoạt động của bộ điều nhiệt không khí tĩnh được gọi là gần như đoạn nhiệt vì sự trao đổi nhiệt qua thành cột nếu có xảy ra thì cũng ở mức độ rất thấp. Hầu như toàn bộ cột chấp nhận nhiệt độ của pha động, tùy thuộc vào tốc độ dòng của pha động. Do đó, việc làm nóng trước pha động là bắt buộc đối với bộ điều nhiệt không khí tĩnh.
Bộ điều nhiệt không khí cưỡng bức cung cấp sự trao đổi nhiệt tăng tốc bằng cách tạo ra đối lưu cưỡng bức cho không khí tuần hoàn. Dòng khí lưu thông càng nhanh thì trao đổi nhiệt giữa nguồn nhiệt và thành cột càng cao. Tuy nhiên, việc ổn định nhiệt độ trên thành cột kém hiệu quả hơn so với bộ gia nhiệt khối nóng. Tuy nhiên, thành cột bên trong bộ điều nhiệt không khí cưỡng bức thể hiện trạng thái đẳng nhiệt hơn là đoạn nhiệt. Khi pha động có nhiệt độ khác, nhiệt độ của thành cột thay đổi một chút nhưng vẫn gần với nhiệt độ buồng cột đã đặt.
Khi nào thì việc làm nóng trước pha động đóng vai trò quan trọng?
Việc gia nhiệt sơ bộ pha động trở nên cần thiết ngay khi cần đạt được hiệu suất tách tối ưu (xem Hình 3). Thể tích ngoài cột (Extra Column Volume – ECV) của bộ tiền gia nhiệt thụ động là một nhược điểm nhất định vì nó cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu năng tách, đặc biệt là với các cột LC lỗ siêu nhỏ (đường kính 1 mm). Các bộ tiền gia nhiệt chủ động không đóng góp vào ECV vì chúng thường được đặt ở một vị trí trên đường ống mao quản vốn có của hệ thống.
Hình 3. Thời gian phân tích ngắn hơn nhờ vào việc tăng nhiệt độ tách
Khi sử dụng bộ điều nhiệt cột đẳng nhiệt, pha động lạnh hơn đi đến sẽ được làm nóng lại dọc theo thành cột đã được tôi luyện trong khi pha động ở giữa cột giữ nhiệt độ lạnh hơn trong một khoảng thời gian nhất định cho đến khi nó cũng nóng lên. Gradient nhiệt độ hướng tâm này dẫn đến sự không đồng đều nhiệt đáng kể trong cột. Khi đó, độ nhớt của pha động dọc theo thành cột sẽ thấp hơn độ nhớt ở giữa cột. Sự khác biệt về tốc độ dòng pha động khác nhau dọc theo thành cột và trung tâm cột xảy ra. Mất hiệu năng tách và thậm chí dẫn đến các peak bị biến dạng (xem Hình 3).
Với bộ điều nhiệt cột đoạn nhiệt, thành cột được làm mát bằng pha động và được làm nóng lại rất chậm bởi bộ điều nhiệt. Tùy thuộc vào tốc độ dòng, toàn bộ cột có thể đáp ứng theo nhiệt độ pha động (xem Hình 3). Do đó, quá trình phân tách sắc ký xảy ra ở nhiệt độ pha động nhưng chứ không phải nhiệt độ buồng cột đã cài đặt. Các khái niệm điều nhiệt cột hiện đại bao gồm bộ tiền gia nhiệt dành cho pha động, hỗ trợ gia nhiệt cột thích hợp với bộ điều nhiệt không khí tĩnh.
Nhiệt ma sát là gì?
Trên thực tế, các pha tĩnh hạt nhỏ tạo ra nhiệt đáng kể do ma sát nhớt của pha động, đặc biệt là khi áp suất ngược trên cột rất cao. Một buồng cột giữ cho thành cột đẳng nhiệt cho phép loại bỏ nhiệt ma sát một cách hiệu quả và tránh sự gia tăng nhiệt độ rõ rệt bên trong cột. Khi nhiệt sinh ra tiêu tán từ tâm cột đến thành cột, quá trình tản nhiệt này tạo ra một gradient nhiệt độ hướng tâm bên trong cột (xem Hình 4).
Trong trường hợp như vậy, tâm cột nóng hơn thành cột. Do tác động kết hợp của nhiệt độ – gây ra khả năng lưu giữ thấp hơn và độ nhớt – gây ra vận tốc tuyến tính cao hơn, các phân tử chất phân tích di chuyển ở trung tâm cột nhanh hơn nhiều so với gần thành cột nơi nhiệt độ thấp hơn. Điều này dẫn đến tình trạng peak giãn rộng và dẫn đến mất hiệu năng tách. Trong một số trường hợp còn quan sát thấy tình trạng biến dạng peak (tương tự như Hình 3).
Nếu sự trao đổi nhiệt giữa thành cột và buồng cột bị triệt tiêu, như trường hợp của bộ điều nhiệt không khí tĩnh đoạn nhiệt, thì nhiệt ma sát vẫn ở bên trong cột. Do đó, nhiệt độ liên tục tăng theo chiều trục từ đầu vào cột đến đầu ra cột khi nhiệt được vận chuyển theo hướng dòng chảy. Đồng thời, độ dốc nhiệt độ xuyên tâm được loại bỏ và tình trạng biến dạng peak do nhiệt độ không đồng đều bị triệt tiêu.
Hình 4. Tác động của gia nhiệt ma sát lên sự phân bố nhiệt độ bên trong cột và sắc ký đồ tương ứng
Những điểm quan trọng nào cần cân nhắc liên quan đến hiệu ứng gia nhiệt ma sát?
Nhìn chung, ảnh hưởng của gia nhiệt ma sát là không đáng kể với HPLC thông thường vận hành ở áp suất dưới 300 bar. Tuy nhiên, nhiệt ma sát trở nên đáng kể khi áp suất ngược của cột lớn hơn 400 bar. Áp suất ngược trên cột càng cao thì nhiệt độ ma sát bên trong cột càng cao. Khi nhiệt ma sát xuất hiện bên trong cột, bộ điều nhiệt không khí tĩnh tạo ra gradient nhiệt độ dọc trục lớn hơn trong khi bộ gia nhiệt khối nóng tạo ra gradient nhiệt độ xuyên tâm lớn hơn. Với bộ điều nhiệt không khí cưỡng bức, tỷ lệ giữa gradient nhiệt độ hướng trục và hướng tâm có thể được kiểm soát bằng cách điều chỉnh tốc độ quạt. Nếu quạt tắt, gradient nhiệt độ dọc trục sẽ được nhận giống như với bộ điều nhiệt không khí tĩnh.
Gradient nhiệt độ hướng tâm có ảnh hưởng lớn hơn đến đặc tính dòng chảy trong cột và hiệu suất tách so với gradient nhiệt độ dọc trục. Gradient nhiệt độ dọc trục làm thay đổi thời gian lưu và trong một số trường hợp, độ chọn lọc do nhiệt độ tách trung bình tăng lên. Ngược lại, hiệu năng của cột không bị ảnh hưởng nặng nề. Hầu hết các hệ thống UHPLC dùng bộ điều nhiệt không khí tĩnh và do đó cột được vận hành trong điều kiện đoạn nhiệt. Khi đó, thời gian lưu và độ chọn lọc có xu hướng thay đổi theo lượng nhiệt ma sát bên trong cột. Điều này rất quan trọng đối với chuyển giao phương pháp khi mà nhiệt độ tách trung bình trở nên khác nhau giữa phương pháp HPLC ban đầu và phương pháp UHPLC tương ứng. Ở áp suất UHPLC điển hình, nhiệt ma sát đóng góp nhiều vào nhiệt độ phân tách trung bình, do đó, cao hơn nhiều so với nhiệt độ cài đặt trong buồng cột cũng như nhiệt độ phân tách trung bình của phương pháp HPLC.
Khi sử dụng nhiệt độ pha động thấp hơn, đến mức cân bằng được sự đóng góp nhiệt do ma sát, nhiệt độ tách trung bình sẽ giống như với phương pháp HPLC. Trong trường hợp đó, phương pháp HPLC và UHPLC sẽ có hệ số dung lượng và độ chọn lọc giống nhau. Một cách tiếp cận tương tự là sử dụng nhiệt độ buồng cột thấp hơn với phương pháp UHPLC. Khi đó, nhiệt độ tách trung bình tương tự cũng đạt được bằng phương pháp HPLC ban đầu và phương pháp UHPLC tương ứng. Cả hai cách tiếp cận đều yêu cầu phương pháp UHPLC phải được thẩm định lại.
Sự giảm hiệu suất tách do gradient nhiệt độ hướng tâm trở nên ít rõ rệt hơn khi đường kính cột giảm. Khi sử dụng bộ điều nhiệt không khí cưỡng bức hoặc bộ gia nhiệt khối nóng với cột UHPLC nhỏ hẹp hoặc siêu nhỏ hiệu suất cao được nhồi bằng các hạt nhỏ hơn 2 µm, sự giảm hiệu suất do gradient nhiệt độ hướng tâm có thể chấp nhận được hơn so với sự thay đổi về thời gian lưu và độ chọn lọc bởi một gradient nhiệt độ dọc trục trong đó bộ điều nhiệt không khí tĩnh sẽ được sử dụng thay thế. Việc thẩm định lại phương pháp UHPLC thường không cần thiết với phương pháp này.
Tồn tại giới hạn nào khi làm việc với nhiệt độ cao hơn môi trường xung quanh?
Các hợp chất rất nhạy cảm với nhiệt độ có khả năng cao sẽ biến đổi theo mỗi lần tăng nhiệt độ cho đến khi chúng phân hủy. Điều này cũng có thể xảy ra với một số chất phụ gia pha động. Áp suất cao trong hệ thống LC cho phép các pha động được sử dụng ở nhiệt độ cao hơn nhiều so với điểm sôi thông thường của chúng. Nhiệt độ và áp suất tới hạn xác định giới hạn trên của quá trình vận hành. Tuy nhiên, hầu hết các cột LC không nên vận hành ở nhiệt độ cao hơn 60–70°C trong thời gian dài. Ở nhiệt độ cao 80–90 °C, khung silica của pha tĩnh hoặc liên kết của nó dễ bị phân hủy, dẫn đến chảy máu cột (column bleeding).
Bên cạnh đó, áp suất hơi của dung môi tăng khi nhiệt độ tăng và bong bóng hơi có thể hình thành. Khi tiến hành phân tách ở nhiệt độ cao trên 60°C, có thể xuất hiện tình trạng sôi của pha động với tỷ lệ thành phần hữu cơ cao trong đầu dò. Điều này xảy ra khi pha động được làm nóng vượt quá điểm sôi ở áp suất môi trường bình thường. Trong quá trình phân tách, sự sôi của pha động bị ức chế bởi áp suất hệ thống cao. Nhiễu đường nền tăng, các peak ma hoặc thậm chí sự hấp thụ ánh sáng hoàn toàn có thể xuất hiện do hiện tượng chảy máu cột, với bọt khí hoặc pha động sôi trong buồng đo của đầu dò (detector flow cell). Ngoài ra, một số buồng đo cũng dễ bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ trên 60°C và có thể bị hỏng.
Việc sử dụng bộ làm mát pha động sau cột duy trì nhiệt độ pha động đủ để vận hành đầu dò một cách phù hợp, chậm nhất là khi làm việc ở nhiệt độ tách cao trên 60°C. Sau khi tách ở nhiệt độ thấp, việc làm ấm pha động trước đầu dò quang học cũng rất hợp lý để tránh sự ngưng tụ hơi ẩm trên hệ quang học. Do đó, bộ trao đổi nhiệt sau cột, cũng có thể được dùng để làm nóng pha động, trở nên quan trọng. Nói chung, nên sử dụng bộ làm mát pha động hoặc bộ trao đổi nhiệt sau cột miễn là thể tích ngoài cột của nó không ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất tách.
Kết luận
Nhiệt độ tách trung bình xác định thời gian lưu, độ chọn lọc, hiệu suất và độ phân giải của quá trình tách sắc ký lỏng. Nhiệt độ buồng cột đã cài đặt và nhiệt độ phân tách thực sự bên trong cột LC chênh lệch nhau khi mà pha động không được làm nóng trước đúng cách hoặc khi nhiệt ma sát xảy ra ở áp tại suất cao không được tính đến. Các buồng cột phải được phân biệt thành các nguyên lý điều nhiệt khác nhau như đẳng nhiệt hoặc đoạn nhiệt. Buồng cột đẳng nhiệt, với bộ gia nhiệt khối nóng và bộ điều nhiệt không khí cưỡng bức là các biến thể quan trọng nhất, tạo ra gradient nhiệt độ hướng tâm trong cột LC nếu nhiệt độ pha động và nhiệt độ buồng không bằng nhau. Nguồn gốc của sự không đồng đều về nhiệt này có thể là do pha động lạnh hơn hoặc nóng hơn (ví dụ, do gia nhiệt ma sát) so với thành cột. Gradient nhiệt độ xuyên tâm bên trong cột LC làm cho peak giãn rộng, thậm chí biến dạng peak và giảm hiệu suất phân tách trong khi thời gian lưu và độ chọn lọc của các hợp chất ít bị ảnh hưởng hơn.
Buồng cột đoạn nhiệt, với bộ ổn nhiệt không khí tĩnh là biến thể duy nhất, bị chi phối bởi nhiệt độ pha động thực tế. Tùy thuộc vào tốc độ dòng, toàn bộ cột LC có thể tuân theo nhiệt độ của pha động thay vì nhiệt độ buồng cột đã đặt. Khi nhiệt ma sát xuất hiện, bộ điều nhiệt không khí tĩnh sẽ tạo ra một gradient nhiệt độ dọc trục trong cột LC. Nhiệt độ tách trung bình tăng lên, thời gian lưu và độ chọn lọc của các hợp chất có thể thay đổi trong khi hiệu suất tách không bị ảnh hưởng. Ngược lại, hiệu suất tách có thể tăng do nhiệt độ tách cao hơn, tùy thuộc vào tốc độ dòng được áp dụng.
Bộ làm mát pha động sau cột hoặc thậm chí tốt hơn là bộ trao đổi nhiệt có khả năng làm nóng và làm mát pha động ở phía trước buồng đo của đầu dò là rất cần thiết khi sử dụng phương pháp LC dưới nhiệt độ môi trường hoặc nhiệt độ cao hoặc khi nhiệt ma sát có xu hướng làm nóng pha động lên trên điểm sôi của nó ở áp suất môi trường bình thường.
Nguồn: White Paper 71499 – Thermo Fisher Scientific
